檢測(cè)原理 :

本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ ELISA）。在預(yù)包被 人γ干擾素(IFN-γ)止抗體（固相抗體）的微孔酶標(biāo)板中，加入 人γ干擾素(IFN-γ) 校準(zhǔn)品和待測(cè)樣本，再加入另一株 HRP標(biāo)記的抗 人γ干擾素(IFN-γ) （酶標(biāo)抗體），經(jīng)過溫育與充分洗滌，去除未結(jié)合的組分，在微孔板固相表面形成固相抗體 -抗原-酶標(biāo)抗體的夾心復(fù)合物。加底物 A和 B，底物在 HRP催化下，產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物，在終止液（2M 硫酸）作用下，最終轉(zhuǎn)化為黃色，在酶標(biāo)儀  450nm波長(zhǎng)上測(cè)定吸光度（OD值），吸光度（OD值）與待測(cè)樣品中 人γ干擾素(IFN-γ)的濃度正相關(guān)。擬合校準(zhǔn)品曲線，可以計(jì)算出樣本中 人(IFN-γ)的濃度。

所需器材和試劑

1、 酶標(biāo)儀 (波長(zhǎng) 450nm 濾光片)

2、37°C  恒溫箱(不推薦使用細(xì)胞用 CO2 培養(yǎng)箱)

3、 自動(dòng)洗板機(jī)或多道移液器 /5ml 滴管(手工洗板用)

4、 無(wú)菌的 EP 管及一次性吸頭

5、 精密的單道 (0.5-10μL, 5-50μL, 20-200μL,  200-1000μL)和多通道移液器(移液器使用前需校準(zhǔn))。

6、吸水紙及加樣槽

7、去離子水或蒸餾水

試劑盒組成：

標(biāo)本收集 :

1、收集血液的試管應(yīng)為一次性的無(wú)熱原，無(wú)內(nèi)毒素試管。

2、 血漿抗凝劑推薦使用 EDTA 。避免使用溶血，高血脂標(biāo)本。

3、標(biāo)本應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除。

4、 標(biāo)本收集后若不及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次使用量分裝，凍存于 -20 ℃ , -70 ℃電冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融，3-6月內(nèi)檢測(cè)。

5、 如果您的樣本中檢測(cè)物濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品高值，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況， 做適當(dāng)倍數(shù)稀釋 (建議做預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定稀釋倍數(shù))。

儲(chǔ)存條件：

樣品采集及保存：

1、 血清全血樣本室溫放置 2小時(shí)或 2-8°C 過夜。1000×g 離心20分鐘，取上清?？闪⒓礄z測(cè)，或按一次使用量分裝凍存于-20°C  或-80°C。

2、 血漿抗凝劑推薦使用 EDTA-Na2/K2，樣品采集后30分鐘內(nèi)于2-8°C，1000×g 離心15分鐘，取上清?？闪⒓礄z測(cè)，或按一次使用量分裝凍存于-20°C  或-80°C。其他抗凝劑的使用及選擇請(qǐng)查看樣品制備指南。

3、組織樣本組織樣本一般制成組織勻漿，處理方法如下：
3.1、 將目標(biāo)組織置于冰上，用預(yù)冷的 PBS緩沖液(0.01M，pH=7.4)洗滌去除殘留的血液，稱重后備用。

3.2、 在冰上用裂解液研磨組織勻漿。加入裂解液的體積取決于組織的重量，一般情況每 1g 組織碎片使用9ml裂解液。另外建議在裂解液中加入蛋白酶抑制劑，如 1mM PMSF。

3.3、 可再利用超聲破碎或反復(fù)凍融進(jìn)一步處理 (超聲破碎過程中，需冰浴降溫；反復(fù)凍融法可重復(fù)2次)。

3.4、 將制備好的勻漿液于 5000×g 離心 5 分鐘，留取上清即可檢測(cè)?；虬匆淮问褂昧糠盅b凍存于-20°C 或-80°C。

3.5、 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，組織勻漿樣本可先測(cè)定總蛋白濃度 ,以便于數(shù)據(jù)分析，推薦 BCA 法。一般調(diào)整總蛋白濃度至 1-3mg/ml 用于 ELISA  檢測(cè)。某些組織樣本，如肝臟，腎臟，胰腺因含有較高濃度的內(nèi)源性過氧物酶, 在樣品濃度較高的情況下會(huì)和顯色底物反應(yīng)，出現(xiàn)假陽(yáng)性?？蓢L試使用 1%H2O2 滅活  15min 再檢測(cè)。

注意： 裂解液常用 PBS 緩沖液，或使用中等強(qiáng)度 RIPA 裂解液。使用 時(shí)，PH 值需調(diào)整為PH7.3，避免使用含 NP-40，Triton X-100 和  DTT 的組分，會(huì)嚴(yán)重抑制試劑盒工作。推薦使用50mM Tris+0.9%NaCL+0.1% SDS,PH  7.3，可自行配制或聯(lián)系我們購(gòu)買。

4、 細(xì)胞培養(yǎng)上清收集上清液， 2-8°C，2500rpm 離心 5min，收集澄清的細(xì)胞培養(yǎng)上清。立即用于檢測(cè)，或按一次使用量分裝于-80°C  凍存?zhèn)溆谩?/span>

5、細(xì)胞裂解液

5.1、 懸浮細(xì)胞的收集及裂解： 2-8°C，2500rpm 離心 5min，收集細(xì)胞。再加入預(yù)冷的 PBS 輕輕混勻清洗，2-8°C，2500rpm 離心  5min，收集細(xì)胞。加入 0.5-1ml 細(xì)胞裂解液及適量蛋白酶抑制劑(如 PMSF，工作濃度 1mmol/L)，置于冰上，裂解 30min-1h ,  或者配合超聲波破碎。

5.2、 貼壁細(xì)胞的收集及裂解：吸走上清液，加入預(yù)冷的 PBS 洗三次。加入 0.5-1ml 細(xì)胞裂解液及適量蛋白酶抑制劑(如PMSF，工作濃度  1mmol/L)，用細(xì)胞刮輕輕刮下貼壁細(xì)胞。細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管中，置于冰上，裂解 30min-1h，或者配合超聲波破碎。

5.3、 細(xì)胞裂解過程中可用槍頭吹打或間斷搖動(dòng)離心管，使蛋白充分裂解 , 出現(xiàn)黏糊狀是 DNA，可以使用超聲波破碎DNA。(或用超聲波 3-5mm 探頭，功率 150-300W, 冰上超聲處理樣品，工作 1-2  秒，停止 30 秒， 3~5 個(gè)循環(huán)。)

5.4、 裂解或超聲破碎完成， 2-8°C，10000rpm 離心 10min，上清移入 EP 管中，立即用于檢測(cè)，或按一次使用量分裝于-80°C  凍存?zhèn)溆谩?/span>

注意：注意事項(xiàng)同組織樣本。

6、 其他生物樣本 2-8°C，1000×g 離心樣品 20 分鐘。收集上清液立即用于檢測(cè)，或按 一次使用量分裝于-80°C  凍存?zhèn)溆谩?/span>

操作步驟：

步驟 1： 向孔中加入 100ul 標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品，貼上覆膜， 37°C 靜置孵育 90 分鐘。

洗板： 洗板 2 次。不浸泡。

步驟 2： 加入 100ul 生物s-抗體工作液，貼上覆膜， 37°C 靜置孵育 60 分鐘。

洗板： 洗板 3 次。每次浸泡 1 分鐘。

步驟 3： 加入 100ul HRP-鏈霉親和素(SABC)工作液，貼上覆膜，37°C 靜置孵育 30 分鐘。

洗板： 洗板 5 次。每次浸泡 1 分鐘。

步驟 4： 添加 90ul TMB 顯色底物。貼上覆膜， 37°C 靜置孵育 10-20 分鐘(請(qǐng)使用 TMB  顯色精準(zhǔn)控制方法)。

步驟 5： 添加 50ul 反應(yīng)終止液。立即在 450nm 處讀取 OD450 值并計(jì)算。

注：以上僅供參考!希望以上信息能幫助您做出合適的選擇!

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